1引言(Introduction)

甲烷(CH4)是僅次于CO2的第2種重要的溫室氣體.如何減排溫室氣體CH4成為了全1球關(guān)注的焦點(diǎn).同時(shí),生物脫氮是當(dāng)前廢水處理領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).污水處理廠中通常通過(guò)硝化和反硝化實(shí)現(xiàn)生物脫氮,而目前城鎮(zhèn)污水普遍存在C/N比低的問(wèn)題,導(dǎo)致在反硝化過(guò)程中往往需要大量的外加碳源.而在污水處理廠的厭氧處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的甲烷,如能將這部分甲烷作為碳源進(jìn)行利用,既減少了甲烷的排放,又節(jié)省了能源的消耗.反硝化型甲烷厭氧氧化反應(yīng)(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,DAMO)正是可以利用甲烷作為碳源完成反硝化脫氮的過(guò)程.DAMO過(guò)程是以甲烷為電子供體和唯1一碳源,以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體的一種氧化還原反應(yīng).2006年,該過(guò)程在實(shí)驗(yàn)室中得以證實(shí)(Raghoebarsingetal.,2006).在自然界中,溶解于水中的甲烷主要靠甲烷氧化菌等通過(guò)生物作用得以消耗;現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在淡水系統(tǒng)、濕地系統(tǒng)、近海海洋生態(tài)系統(tǒng)中(Deutzmannetal.,2011;Lueskenetal.,2011;Kojimaetal.,2012;Wangetal.,2012;Hanetal.,2013;Shenetal.,2013;Shenetal.,2014)均有存在可以耦合甲烷厭氧氧化作用(AnaerobicOxidationofMethane,AOM)和反硝化作用(Denitrification)的DAMO(DenitrifyingAnaerobicMethaneOxidation,反硝化型甲烷厭氧氧化)微生物.根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析,研究者檢測(cè)到的DAMO細(xì)菌隸屬于NC10門(mén)細(xì)菌;DAMO古菌則屬于甲烷厭氧氧化古菌ANME-2(Raghoebarsingetal.,2006).2017年,Wang等(2017)提出了側(cè)流式、主流式兩種DAMO反應(yīng)應(yīng)用于污水處理廠的設(shè)想.

目前污水處理廠進(jìn)水多為低碳高氮性質(zhì),多種化工、制藥廢水及垃圾滲濾液等,都含有較高濃度的氨氮,而高濃度的氨氮會(huì)對(duì)活性污泥中的微生物起抑制作用(鄭雄柳等,2014),并會(huì)影響系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu).目前已有研究報(bào)道高濃度氨氮對(duì)活性污泥系統(tǒng)中硝化細(xì)菌、厭氧氨氧化細(xì)菌等微生物具有抑制作用(Zhouetal.,2011),但對(duì)DAMO微生物的影響及機(jī)理鮮見(jiàn)報(bào)道.如欲將DAMO工藝應(yīng)用于廢水生物脫氮,探明氨氮對(duì)該過(guò)程的影響顯得尤為重要.因此,本文利用已經(jīng)成功富集的以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌種的系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)DAMO細(xì)菌系統(tǒng))(樓菊青等,2016)為研究對(duì)象,通過(guò)短期和長(zhǎng)期試驗(yàn),從宏觀和微觀兩個(gè)層面,研究氨氮對(duì)DAMO過(guò)程脫氮性能、微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響,綜合考察DAMO細(xì)菌對(duì)氨氮的應(yīng)激性、耐受性,并探索其抑制機(jī)理.為促進(jìn)對(duì)DAMO微生物脫氮機(jī)理的研究和完善DAMO理論的發(fā)展添磚加瓦,為該工藝向?qū)嶋H工程應(yīng)用推進(jìn)一步.

2試驗(yàn)材料與方法(Materialsandmethods)

2.1材料

2.1.1試驗(yàn)系統(tǒng)

本文的試驗(yàn)系統(tǒng)是基于之前已成功富集的以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌種的混培物(樓菊青等,2016).所得混培物是以淡水河道(西溪河)底泥、淡水湖泊(西湖)底泥及水稻農(nóng)田土壤的混合物為接種污泥,甲烷和亞硝酸鹽為唯1一碳氮源.至本試驗(yàn)止,系統(tǒng)已穩(wěn)定運(yùn)行1392d.

2.1.2試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為特制的直徑為7.5cm、高度為17cm的500mL厭氧反應(yīng)器.

2.2試驗(yàn)方法2.2.1短期試驗(yàn)方法

①不同濃度氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的影響：通過(guò)批式實(shí)驗(yàn)研究氨氮對(duì)以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌種系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)DAMO細(xì)菌系統(tǒng))的短期影響,設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組,試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)7d,氨氮濃度梯度分別為50、250、500、750、1000、1250、1500mg˙L-1.每12h取3mL水樣,利用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)行三氮(氨氮NH4+-N、硝態(tài)氮NO3--N、亞硝態(tài)氮NO2--N)的測(cè)定.在***氨氮梯度濃度試驗(yàn)后,取泥水混合液10mL進(jìn)行掃描電鏡分析實(shí)驗(yàn).②不同pH體系下氨氮的影響：根據(jù)上述短期試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行批式試驗(yàn),選取750mg˙L-1氨氮作為試驗(yàn)濃度.用0.1mol˙L-1HCl或0.1mol˙L-1NaOH分別將pH調(diào)節(jié)為6.5、6.8、7.0、7.5、7.85個(gè)濃度并利用pH計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)器內(nèi)的pH值,使其保持在相應(yīng)的范圍內(nèi),每組試驗(yàn)持續(xù)7d.取樣與測(cè)定同①.當(dāng)T=27℃時(shí),不同pH體系對(duì)應(yīng)的FA濃度可由公式(1)計(jì)算得到.

(1)

式中,cFA為FA的濃度(mg˙L-1);cNH4+為氨氮的濃度(mg˙L-1);T為溫度(℃)

2.2.3長(zhǎng)期試驗(yàn)方法

氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的長(zhǎng)期影響試驗(yàn)以短期試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),將長(zhǎng)期試驗(yàn)分為連續(xù)的4個(gè)階段,每個(gè)階段7d,這4個(gè)階段的氨氮濃度按照短期試驗(yàn)濃度依次遞增(李媛,2014),濃度分別為500、750、1000、1250mg˙L-1,在28d后取樣進(jìn)行高分子通量測(cè)序.

2.3分析方法2.3.1常規(guī)指標(biāo)測(cè)定

NO3--N、NO2--N、NH4+-N測(cè)定方法參考《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》第四版(魏復(fù)盛,2002).

2.3.2微生物微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

利用掃描電鏡對(duì)微生物微觀形態(tài)進(jìn)行特性分析.在每個(gè)階段的短期試驗(yàn)過(guò)程中,取10mL樣品,在4000r˙min-1條件下離心5min,取上清液,樣品處理后用掃描電子顯微鏡SEM(SU8010,Hitachi)進(jìn)行微生物微觀形態(tài)的特性分析.

2.3.3微生物群落結(jié)構(gòu)分析

提取長(zhǎng)期試驗(yàn)前后污泥樣品中的基因組DNA,儲(chǔ)于-20℃以下,并利用高通量測(cè)序分析.利用上海申能博1彩生物科技有限公司生產(chǎn)的3S柱離心式DNA抽提試劑盒進(jìn)行樣品DNA的提取;利用特定PCR引物進(jìn)行序列擴(kuò)增,全部樣本按照正式試驗(yàn)條件均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn);參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量,之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合;通過(guò)構(gòu)建Miseq文庫(kù)、Miseq測(cè)速對(duì)16SRNA序列進(jìn)行測(cè)序;區(qū)分樣本后,采用RDPclassifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),并在門(mén)、綱、屬3個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成.

3結(jié)果與討論(Resultsanddiscussion)

3.1氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的短期影響

3.1.1氨氮對(duì)以DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響

不同濃度梯度(50~950mg˙L-1)的氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的脫氮性能影響見(jiàn)圖1.其中圖1a表示不同濃度氨氮作用下,系統(tǒng)內(nèi)亞硝酸氮的消耗曲線(xiàn),圖1b表示不同濃度下亞硝酸氮的消耗速率與對(duì)照組的比值,以v表示試驗(yàn)組亞硝酸氮的消耗速率,v0表示對(duì)照組亞硝酸氮的消耗速率.其中誤差范圍由標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.

圖1

圖1不同濃度NH4+-N對(duì)DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響(a.NO2--N消耗曲線(xiàn),以N計(jì);b.試驗(yàn)組與對(duì)照組的比值)

當(dāng)控制pH實(shí)驗(yàn)條件為7.0時(shí),通過(guò)公式(1)計(jì)算可知FA=4.879mg˙L-1,由圖1可見(jiàn),在一1定范圍內(nèi),DAMO細(xì)菌脫氮性能隨著氨氮濃度的增加而降低.由圖1a可知,在空白對(duì)照組中,其亞硝酸鹽初始濃度為30.19mg˙L-1,7d平均消耗速率為2.92mg˙L-1˙d-1.在50、250mg˙L-1氨氮作用下,系統(tǒng)的亞硝酸氮的消耗速率分別為2.94mg˙L-1˙d-1和2.96mg˙L-1˙d-1.相比于對(duì)照組,消耗速率略有上升,但經(jīng)過(guò)單因素方差分析后可知,其p值為0.65,大于0.05,說(shuō)明3組數(shù)據(jù)無(wú)顯著性差異,從而表明在50、250mg˙L-1氨氮作用下,系統(tǒng)的脫氮性能并未出現(xiàn)抑制或促進(jìn)現(xiàn)象(故該兩組數(shù)據(jù)未在圖1a中表示).而當(dāng)氨氮濃度增加至500mg˙L-1時(shí),7d平均亞硝酸鹽消耗速率下降為2.42mg˙L-1˙d-1,其消耗速率為對(duì)照組的82.71%.當(dāng)氨氮濃度為750mg˙L-1時(shí),7d平均消耗速率與對(duì)照組相比,下降了43.15%.當(dāng)在1000mg˙L-1氨氮抑制條件下,經(jīng)7d的消耗后,消耗速率下降了56.20%.在1250mg˙L-1氨氮抑制條件下,亞硝酸鹽7d平均消耗速率僅為對(duì)照組的27.27%.Dapena-Mora等的研究認(rèn)為針對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌,氨氮的IC50為770mg˙L-1,與本試驗(yàn)結(jié)果相近(Dapena-MoraA,2007),可見(jiàn),DAMO細(xì)菌對(duì)高氨氮廢水表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗沖擊負(fù)荷的能力.這有利于DAMO細(xì)菌系統(tǒng)在含高氨氮廢水處理廠中的應(yīng)用.

3.1.2不同pH條件下氨氮對(duì)以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌種系統(tǒng)的影響

根據(jù)3.1.1節(jié)的短期試驗(yàn)結(jié)果,選取750mg˙L-1的氨氮濃度進(jìn)行試驗(yàn).當(dāng)T=27℃,不同pH體系下,對(duì)應(yīng)的FA的濃度可由公式(1)計(jì)算得到,計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1.

圖2為不同pH時(shí),DAMO細(xì)菌系統(tǒng)受氨氮影響時(shí)的脫氮性能.以pH=7.0為對(duì)照組,各pH條件下脫氮速率與該條件下脫氮速率比值為縱坐標(biāo),得圖2b,由圖2可知,在堿性條件下(pH=7.0、7.5、8.0),同樣為750mg˙L-1的氨氮,隨著pH升高,FA升高,脫氮速率下降,當(dāng)pH=8.0時(shí),其FA濃度為46.09mg˙L-1,此時(shí)脫氮速率不到對(duì)照組的1/2,且對(duì)pH=7.0、7.5、8.0條件下所得3組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,其p值為9.93×10-5,遠(yuǎn)小于0.01,說(shuō)明這3組數(shù)據(jù)之間有極顯著差異;而在酸性條件下(pH=6.5、6.8、7.0),雖然FA值隨著pH值的升高而升高,但通過(guò)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)脫氮速率與FA值并無(wú)顯著性差異.這說(shuō)明在堿性條件下,氨氮對(duì)系統(tǒng)的抑制效果與FA值有關(guān),FA是限制性抑制因子,該結(jié)果與氨氮對(duì)其他微生物抑制的大多數(shù)研究結(jié)果相吻合(Anthonisen,1976);在酸性條件下,抑制效果與FA的濃度無(wú)關(guān),認(rèn)為離子化氨氮應(yīng)是真正的抑制因子.該結(jié)果與之前部分研究相吻合,當(dāng)溶液呈酸性(pH<7.0)時(shí),厭氧氨氧化菌、甲烷菌、反硝化菌等微生物活性受到抑制;甲烷菌(Lay,1997)等的活性取決于離子化氨氮NH4+的濃度,而不是質(zhì)子化氨氮FA的濃度.

圖2

圖2不同pH下NH4+-N對(duì)DAMO細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)NO2-消耗情況及脫氮性能的影響(a.不同pH條件下NO2--N消耗曲線(xiàn);b.不同pH條件下NH4+-N對(duì)系統(tǒng)脫氮性能的影響)

3.1.3氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的微觀形態(tài)影響

在1500mg˙L-1的氨氮抑制試驗(yàn)7d后,取污泥混合液10mL離心后,利用掃描電鏡分別觀察抑制前后的污泥結(jié)構(gòu)與微生物微觀形態(tài)特性,結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知,氨氮抑制試驗(yàn)之前,在SEM下的絮狀污泥微觀結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn),細(xì)菌形狀多樣,以菌膠團(tuán)的形式聚合在一起,其中占主導(dǎo)地位的是球狀菌和短桿狀菌,絲狀菌數(shù)量較少.菌的表面較為光滑,附著有少量胞外聚合物(ExtracellularPolymericSubstances,EPS).具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)更多相關(guān)技術(shù)文檔。

圖3

圖3氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)掃描電鏡照片(a.氨氮抑制前,b.氨氮抑制后)

經(jīng)高濃度氨氮短期抑制后的污泥與抑制之前相比,結(jié)構(gòu)變得松散,絲狀菌大量繁殖,球狀菌和短桿狀菌則大量減少,污泥出現(xiàn)了明顯的膨脹現(xiàn)象.而污泥中的微生物出現(xiàn)了明顯的皺縮現(xiàn)象,另外微生物表面還包裹著一層粘性物質(zhì).由于聚合物覆蓋在微生物的表面,在環(huán)境與微生物胞膜之間形成一個(gè)緩沖層,這種緩沖層有助于保護(hù)細(xì)胞體免受有毒物質(zhì)損害,從生物反饋機(jī)制上理解：在環(huán)境條件改變的情況下,微生物分泌大量EPS的行為可以歸結(jié)為生物應(yīng)激性的一種表現(xiàn),從而能夠大程度地避免微生物細(xì)胞體受危害.所以,微生物表面包裹著的這層粘性物質(zhì)應(yīng)為細(xì)菌所分泌的EPS(鄭雄柳,2014),用以抵抗外界的不利因素.

3.2氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的長(zhǎng)期影響3.2.1氨氮對(duì)以DAMO細(xì)菌脫氮性能的影響

氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌系統(tǒng)長(zhǎng)期抑制后對(duì)系統(tǒng)脫氮性能影響結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4

圖4DAMO細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)NO2--N消耗曲線(xiàn)及長(zhǎng)期抑制對(duì)脫氮性能的影響(a.系統(tǒng)NO2--N消耗曲線(xiàn);b.長(zhǎng)期抑制對(duì)系統(tǒng)脫氮性能的影響)Fig.4NO2--NconsumptionandnitrogenremovalperformanceinDAMObacteriaSystemunderlongterminhibition(a.NO2--Nconsumptioncurve;b.nitrogenremovalperformanceinDAMObacteriaSystem)

控制***階段(1~7d)氨氮濃度維持在500mg˙L-1左右,亞硝酸鹽初始實(shí)測(cè)濃度為29.95mg˙L-1,7d內(nèi)平均消耗速率為2.37mg˙L-1˙d-1,與空白對(duì)照組相比其消耗速率下降了20.80%(圖4b),出現(xiàn)明顯抑制效應(yīng),此時(shí)抑制效果與短期試驗(yàn)基本沒(méi)有差別.控制第二階段(8~14d)氨氮的濃度為750mg˙L-1左右,亞硝酸鹽初始實(shí)測(cè)濃度為30.95mg˙L-1,7d平均消耗速率為1.14mg˙L-1˙d-1,與對(duì)照組相比其消耗速率下降62.02%,而同樣為750mg˙L-1的短期試驗(yàn)中,其消耗速率只下降了43.15%.第三階段(15~21d)氨氮的濃度控制在1000mg˙L-1左右,該階段亞硝酸鹽初始濃度為31.91mg˙L-1,7d平均消耗速率為0.54mg˙L-1˙d-1,其消耗速率僅僅達(dá)到了對(duì)照組的18.04%(圖4b),而短期試驗(yàn)該濃度下的NO2--N消耗速率卻還有對(duì)照組的43.80%,可見(jiàn),與短期抑制相比,在長(zhǎng)期抑制條件下,氨氮的毒性具有累積效應(yīng).

當(dāng)氨氮的濃度上升到1250mg˙L-1時(shí)(22~28d),7d內(nèi)其亞硝酸氮的消耗速率僅為對(duì)照組的6.69%,且經(jīng)過(guò)單因素方差分析后發(fā)現(xiàn),與氨氮濃度為1000mg˙L-1條件下所得數(shù)據(jù)并無(wú)顯著性差異,從而表明當(dāng)控制氨氮濃度為1000mg˙L-1時(shí),DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的脫氮性能已基本被抑制.在長(zhǎng)期抑制試驗(yàn)的pH條件下(7.0),氨氮濃度為500、750、1000mg˙L-1時(shí),其相對(duì)應(yīng)的FA分別為3.253、4.879、6.505mg˙L-1,其FA濃度依次升高,而根據(jù)3.1.2節(jié)試驗(yàn)結(jié)果可知,在pH=7.0~7.5條件下,氨氮對(duì)系統(tǒng)的抑制效果與FA值相關(guān),FA增加,抑制效果增強(qiáng).

3.2.2氨氮對(duì)DAMO系統(tǒng)菌群結(jié)構(gòu)的影響

本試驗(yàn)利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)Miseq高通量測(cè)序揭示氨氮抑制前后微生物群落多樣性的變化,結(jié)果詳見(jiàn)表2.其中,Coverage表示樣本文庫(kù)的覆蓋率,其數(shù)值越高,則樣本中序列被測(cè)出的概率就越高,該指數(shù)反應(yīng)測(cè)序結(jié)果是否代表了微生物的真實(shí)情況.在本試驗(yàn)中,所有Coverage指數(shù)均為99.85%,故此次測(cè)序結(jié)果真實(shí)可靠.由表2可知,在經(jīng)過(guò)4周高濃度氨氮抑制之后,OTUs的數(shù)值出現(xiàn)了明顯的下降,DAMO細(xì)菌系統(tǒng)初始的OTUs為288.00,但抑制后僅為227.00,此外,表征群落豐度的指標(biāo)Chao1值和Ace值也分別從320.00、328.98下降到255.27和255.64,說(shuō)明在抑制過(guò)程中系統(tǒng)內(nèi)物種數(shù)不斷減少.而表征群落多樣性的指標(biāo),Shannon指數(shù)從3.11下降到2.26;Simpson指數(shù)從0.09上升到0.11,說(shuō)明抑制過(guò)程中系統(tǒng)內(nèi)群落多樣性在不斷減少.綜上可知,氨氮對(duì)以DAMO細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌種的微生物系統(tǒng)有明顯的抑制作用,長(zhǎng)期抑制后,微生物系統(tǒng)的物種豐度以及多樣性明顯下降.

基于第二代高通量測(cè)序技術(shù)Miseq高通量測(cè)序,對(duì)16SRNA序列進(jìn)行測(cè)序.氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)的微觀群落結(jié)構(gòu)組成見(jiàn)圖5.

圖5

圖5氨氮抑制前后DAMO細(xì)菌系統(tǒng)微觀群落結(jié)構(gòu)(a.氨氮抑制前;b.氨氮抑制后)

從圖5可見(jiàn),氨氮對(duì)系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)有較大影響.

從門(mén)的層次上,氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前后均檢測(cè)到28類(lèi)已知門(mén)類(lèi)的細(xì)菌,其中氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前占優(yōu)勢(shì)地位的是變形菌門(mén)(Proteobacteria,35.13%)、綠菌門(mén)(Chlorobi,30.25%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes,14.03%)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi,12.54%).這幾類(lèi)細(xì)菌都是厭氧脫氮生物反應(yīng)器中常見(jiàn)的細(xì)菌(Guo,2015;Shu,2015).而在氨氮抑制實(shí)驗(yàn)以后,占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的門(mén)類(lèi)細(xì)菌種類(lèi)不變,但其比例已較抑制前發(fā)生較大改變,變形菌門(mén)(Proteobacteria)從35.13%上升到67.23%,綠菌門(mén)(Chlorobi)的比例從抑制前的30.25%下降到抑制后的16.94%,而綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)從12.54%下降到3.84%,浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)的比例從14.03%下降到1.08%.變形菌門(mén)在高濃度氨氮氮條件下比例升高,說(shuō)明高濃度氨氮對(duì)其有一1定的促進(jìn)作用;而對(duì)于綠菌門(mén)門(mén)、綠彎菌門(mén)及浮霉菌門(mén),抑制作用則十分顯著.

在綱的層次上進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),氨氮抑制實(shí)驗(yàn)前,變形菌門(mén)中Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Gammaproteobacteria均被檢測(cè)到,其比例分比為：8.75%,8.46%,3.09%,14.63%.但占比大的是隸屬于綠菌門(mén)的Ignavibacteria(28.72%).系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)菌群為屬于綠菌門(mén)的Melioribacter,屬于變形菌門(mén)的Methylomonas(甲基單胞菌屬),及屬于浮霉菌門(mén)的SM1A02,其比例分別為19.66%,13.84%和13.07%.其次是屬于浮霉菌門(mén)的Phycisphaerae占比13.97%,以及屬于綠彎菌門(mén)的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)占6.68%.綠彎菌門(mén)所屬細(xì)菌多為厭氧細(xì)菌.Melioribacter所屬的Ignavibacteria是綠菌門(mén)中唯1一一類(lèi)化能自養(yǎng)菌,兼性厭氧(Podosokorskaya,2013),它與浮霉菌門(mén)的SM1A02都曾在厭氧氨氧化或其他具有反硝化功能的微生物系統(tǒng)中被檢測(cè)到(Chu,2015).而在氨氮抑制實(shí)驗(yàn)以后,深入分析發(fā)現(xiàn),隸屬于綠菌門(mén)的Ignavibacteria其比例由抑制前的28.72%下降到10.44%,這也是綠菌門(mén)比例下降的主要原因,另外屬于綠菌門(mén)(Chlorobi)的綠硫細(xì)菌(Chlorobia)的比例從1.53%上升到6.51%.屬于綠彎菌門(mén)的Anaerolineae(厭氧蠅菌綱)也在氨氮的作用下由之前的6.68%下降到3.09%.屬于浮霉菌門(mén)的Phycisphaerae抑制前占比13.97%,抑制后下降到0.99%.由此表明,氨氮對(duì)Ignavibacteria、Anaerolineae以及Phycisphaerae有明顯的抑制作用.而在變形菌門(mén)中,除Betaproteobacteria的比例從8.46%下降到6.58%外,Alphaproteobacteria,Deltaproteobacteria,Gammaproteobacteria其比例分別從8.75%,3.09%,14.63%上升至18.71%,5.20%,35.70%,這直接導(dǎo)致了在門(mén)的水平上,變形菌門(mén)比例的顯著上升,說(shuō)明氨氮對(duì)變形菌門(mén)的促進(jìn)作用主要集中在Alphaproteobacteria、Deltaproteobacteria以及Gammaproteobacteria.

通過(guò)對(duì)屬水平上群落結(jié)構(gòu)的分析可發(fā)現(xiàn),優(yōu)勢(shì)菌種在高濃度氨氮作用下發(fā)生了改變,原本的優(yōu)勢(shì)菌是屬于綠菌門(mén)的Melioribacter,但其比例從抑制前的19.66%下降到7.58%,說(shuō)明該類(lèi)菌對(duì)高氨氮的耐受性較差;屬于變形菌門(mén)的Methylomonas(甲基單胞菌屬),其比例從13.84%下降到0.01%,這種甲烷氧化細(xì)菌比例的下降,應(yīng)是系統(tǒng)脫氮性能下降的原因之一,Methylomonas(甲基單胞菌屬)在甲烷濃度較低的環(huán)境中具有一1定的競(jìng)爭(zhēng)力(Zeng,2016),Kim等在該菌屬的細(xì)菌中檢測(cè)到了編碼甲烷單加氧酶(MMO)的基因而甲烷單加氧酶是甲烷氧化過(guò)程的***步也是關(guān)鍵一步的催化劑(Kim,2016),同時(shí)在荷蘭的Lieshout污水處理廠底泥的DAMO分子檢測(cè)結(jié)果可知在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中(Luesken,2011)、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)富集成功的DAMO微生物的Illumina序列分析結(jié)果中(Siniscalchi,2017)等均有發(fā)現(xiàn)該菌屬的存在;屬于浮霉菌門(mén)的SM1A02,其比例從13.07%下降到0.26%;同時(shí)出現(xiàn)了新的優(yōu)勢(shì)菌種,與Methylomonas(甲基單胞菌屬)同屬于變形菌門(mén)Gammaproteobacteria的Arenimonas其比例由0.01%上升到29.17%,說(shuō)明該類(lèi)細(xì)菌在受長(zhǎng)期高濃度氨氮影響的DAMO細(xì)菌系統(tǒng)中具有一1定優(yōu)勢(shì),亦對(duì)高濃度氨氮有較強(qiáng)的耐受能力.該類(lèi)細(xì)菌多為桿狀菌,革蘭氏陰性菌,無(wú)芽孢,無(wú)鞭毛,不可移動(dòng),但對(duì)于其在脫氮微生物系統(tǒng)中的作用尚不明朗.另外由于自然界中含有大量的不可培養(yǎng)或難以培養(yǎng)的微生物,導(dǎo)致眾多菌群的生物學(xué)分類(lèi)是未知的,因而在序列信息比對(duì)過(guò)程中,數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到屬水平的菌種只是自然界的一部分,大量的有效序列目前還無(wú)法找到合適的配對(duì)信息,同時(shí)表明,系統(tǒng)中囊括了未知菌屬,需要進(jìn)一步深入探究.

綜上可知,在氨氮長(zhǎng)期抑制作用下,DAMO細(xì)菌系統(tǒng)中物種豐度,多樣性以及群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變,而Methylomonas(甲基單胞菌屬)的減少應(yīng)是系統(tǒng)脫氮性能下降的主要原因.

4結(jié)論(Conclusions)

1)高濃度氨氮會(huì)影響DAMO微生物的生長(zhǎng)和性能.在短期抑制條件下,氨氮對(duì)DAMO細(xì)菌的安全濃度為250mg˙L-1;當(dāng)氨氮濃度增至500mg˙L-1時(shí),DAMO細(xì)菌的脫氮效率受到明顯抑制,隨著濃度、時(shí)間的增加,氨氮對(duì)其的抑制效果增強(qiáng);當(dāng)氨氮濃度增加到1500mg˙L-1時(shí),系統(tǒng)基本喪失脫氮性能.

2)抑制前后的污泥結(jié)構(gòu)與微生物微觀形態(tài)特性經(jīng)過(guò)掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn),高濃度氨氮短期抑制后,污泥結(jié)構(gòu)均變得松散,絲狀菌大量繁殖,球狀菌和短桿狀菌則大量減少,污泥出現(xiàn)明顯的膨脹現(xiàn)象,同時(shí)微生物分泌大量EPS,以抵抗外界的不利環(huán)境.

3)在不同pH體系下,起到真正抑制作用的抑制因子不同,在堿性條件下,FA為主要抑制因子;在酸性條件下,離子化的氨氮為主要的抑制因子.

4)在相同氨氮抑制濃度下,與短期試驗(yàn)相比較,長(zhǎng)期抑制條件下DAMO細(xì)菌脫氮速率更低.氨氮濃度增加到1250mg˙L-1時(shí),脫氮性能就被完全抑制.

5)高通量測(cè)序技術(shù)分析結(jié)果顯示,經(jīng)長(zhǎng)期的氨氮抑制后,DAMO系統(tǒng)內(nèi)的物種多樣性和豐度都大大降低,菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變,變形菌門(mén)比例明顯上升,綠菌門(mén)、綠彎菌門(mén)及浮霉菌門(mén)比例下降.尤其是Methylomonas(甲基單胞菌屬)數(shù)量的減少,導(dǎo)致了系統(tǒng)脫氮效率降低.